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技术贴|史上最全IHC攻略,这谁顶得住?

来源: 武汉金开瑞生物工程有限公司   2019-10-30   访问量:562评论(0)

金开瑞的IHC验证图

金开瑞专注于抗体定制多年,一站式的抗体服务、多样性的宿主系统、规模化的生产、严格的质控标准,使得金开瑞的定制抗体稳定可靠,满足客户的应用需求,深受国内外客户的欢迎。
一张漂亮的IHC图是怎么诞生的?实验过程中我们应该注意些什么呢?
话不多说,直接上干货,现在小编就跟大家分享IHC 实验中可能出现的各种问题及应对策略,希望给科研君的实验带来实实在在的帮助~
问题 原因 解决方案
边缘效应 组织边缘贴附不牢,边缘组织松脱漂浮于液体中 APES/多聚赖氨酸处理玻片;组织切片尽量薄;尽量避免选用坏死较多的组织
试剂未充分覆盖组织 滴加试剂时让试剂完全覆盖组织
非特异性染色 抗体质量问题 使用质量有保证的抗体
抗体孵育时间长 减少孵育时间
抗体浓度过高 降低抗体浓度
一抗为多抗 使用单克隆抗体
内源性过氧化物酶及生物素 延长灭活时间
封闭不足 延长封闭时间
DAB孵育时间过久或浓度过高 按说明书配置试剂,镜下控制反应时间
抗体孵育后洗涤不充分 每次孵育之后洗3*5次
实验过程干片 及时滴加试剂
阴性结果 抗体浓度及质量 选择有质量保证的抗体,先做预实验摸索抗体使用浓度
抗原修复不足 摸索合适的抗原修复方式及修复时间
封闭时间过长 减少封闭时间
DAB孵育时间短 镜下控制显色时间
细胞通透不全,抗体未能进入细胞反应 选择合适的通透剂及其反应时间
一抗二抗不匹配 选择正确来源的二抗
脱片 玻片未处理好 玻片清洗干净后用APES或多聚赖氨酸处理
切片厚薄不均匀 更换刀片;调整好切片机状态
烤片时间或温度不够 60℃ 2小时
组织自身问题 肿瘤坏死组织及骨组织本身易脱片
抗原修复时温度迅速变化 抗原修复后让其自然冷却
染色弱 抗体浓度低,孵育时间短 提高抗体浓度,延长反应时间
试剂使用超过有效期 试剂定时更新
滴加试剂时残余缓冲液过多使试剂稀释 滴加试剂前尽量减少残余液体
封闭过度 减少封闭时间
着色不均匀 切片厚度不一致 更换刀片;调整好切片机状态
剂配制未混匀使局部浓度不一致 试剂充分混匀后滴加
试剂未完全覆盖组织 滴加试剂时让试剂完全覆盖组织
脱蜡不完全 更换脱蜡剂或延长脱蜡时间



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